株式会社  ペルセウスプロテオミクス
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実験プロトコル

免疫染色
1.4μmの切片を作製
2.脱パラフィン(5分間3回浸漬)・親水化
3.抗原賦活処理
  1)抗原賦活液としてpH6.0-7.0 (好ましくはpH6.0-6.5) クエン酸バッファーを耐熱性のドーゼに入れ、
    オートクレーブで121℃ 15分間熱処理
  2)熱処理後、染色ドーゼを常温で40分間放置(体温程度に冷却)
  3)スライドを取り出し、PBS(又は、精製水)にて5分間3回洗浄
4.内因性ペルオキシダ-ゼのブロッキング
  1)0.3%過酸化水素を含むメタノールに20-30分間浸漬
  2)PBSで5分間3回洗浄
  3)ブロッキングのため、正常血清で10分間処理(これは、二次抗体の性能により、省略できる。)
5.一次抗体反応
  1)抗体希釈液用緩衝液(1%BSA-PBS、0.1%アジ化ナトリウム)で希釈した一次抗体*を切片上に滴下
  *抗体使用推奨濃度:5μg/mL~50μg/mL
  2)室温 2時間、好ましくは4℃で一晩反応
  3)PBSで切片上の一次抗体を洗い流し、PBSに5分間3回浸漬
6.二次抗体反応
  1)二次抗体(例えば、シンプルステインMAX-PO MULTI (ニチレイ))と、室温で0.5-2時間(好ましくは0.5-1時間)反応
  2)PBSで切片上の試薬を洗い流し、PBSに5分間3回浸漬
7.発色基質溶液
  1)0.05Mトリスバッファー(TBS)(pH7.4) 100mLに対して10mgDABと10μL過酸化水素(30%)を加え、常温、5-10分間反応
  2)流水でよく洗浄(~3分間)
8.核染色
  必要に応じてヘマトキシリン、メチルグリーン**などで染色する
  **ヘマトキシリンを使用する場合は、短時間(~0.5分間)で染色する
9.脱水処理等
  エタノール濃度を順次上げて(50%、70%、96%、absolute)脱水処理後に透明化(xylol、3分間3回浸漬)
10.封入


2012年10月24日