免疫染色

1. 4μmの切片を作製
2. 脱パラフィン（5分間3回浸漬）・親水化
3. 抗原賦活処理
   • １）抗原賦活液としてpH6.0-7.0 （好ましくはpH6.0-6.5） クエン酸バッファーを耐熱性のドーゼに入れ、オートクレーブで121℃　15分間熱処理
   • ２）熱処理後、染色ドーゼを常温で40分間放置（体温程度に冷却）
   • ３）スライドを取り出し、PBS（又は、精製水）にて5分間3回洗浄
4. 内因性ペルオキシダ-ゼのブロッキング
   • １）0.3%過酸化水素を含むメタノールに20-30分間浸漬
   • ２）PBSで5分間3回洗浄
   • ３）ブロッキングのため、正常血清で10分間処理（これは、二次抗体の性能により、省略できる。）
5. 一次抗体反応
   • １）抗体希釈液用緩衝液（1%BSA-PBS、0.1％アジ化ナトリウム）で希釈した一次抗体＊を切片上に滴下
     ＊抗体使用推奨濃度：1μg/mL～50μg/mL
   • ２）室温 2時間、好ましくは4℃で一晩反応
   • ３）PBSで切片上の一次抗体を洗い流し、PBSに5分間3回浸漬
6. 二次抗体反応
   • １）二次抗体（例えば、シンプルステインMAX-PO MULTI (ニチレイ)）と、室温で0.5-2時間（好ましくは0.5-1時間）反応
   • ２）PBSで切片上の試薬を洗い流し、PBSに５分間3回浸漬
7. 発色基質溶液
   • １）0.05Mトリスバッファー(TBS)(pH7.4) 100mLに対して10mgDABと10μL過酸化水素(30%)を加え、常温、5-10分間反応
   • ２）流水でよく洗浄（～3分間）
8. 核染色
   • 必要に応じてヘマトキシリン、メチルグリーン**などで染色する
     ＊＊ヘマトキシリンを使用する場合は、短時間（～0.5分間）で染色する
9. 脱水処理等
   • エタノール濃度を順次上げて(50%、70%、96%、absolute)脱水処理後に透明化(xylol、3分間3回浸漬)
10. 封入